郝相慧杨玲玲周丽徐海峰
基金项目
国家科技重大专项基金资助（编号：ZX）；国家自然科学基金资助（编号：）
作者单位
山东省济南市，山东第一医科大学，山东省医学科学院（郝相慧）；山东省青岛市，山东省眼科研究所，山东省眼科学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地（郝相慧，杨玲玲，周丽，徐海峰）；山东省青岛市，山东第一医科医院（徐海峰）
摘要
目的观察贝伐单抗（BEV）对人视网膜色素上皮（RPE）细胞氧化应激损伤和上皮间质转化（EMT）的影响，进一步探讨抑制活性氧（ROS）在EMT中的作用。方法选取人ARPE-19细胞株，根据实验需要将ARPE-19细胞分为4组：空白对照组、BEV组、BEV+NAC组和BEV+DPI组，其中空白对照组细胞不进行任何干预，BEV组用0.25g·L-1BEV处理细胞72h，另外两组在BEV处理细胞24h后分别再用ROS抑制剂NAC和NADPH氧化酶抑制剂DPI处理细胞48h。采用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色观察各组ARPE-19细胞内ROS和H2O2的生成堆积情况；细胞免疫荧光观察各组ARPE-19细胞中EMT标志物［紧密连接相关蛋白闭锁带蛋白-1（ZO-1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和纤维连接蛋白（FN）］的表达情况；再通过RT-PCR和Westernblot检测各组细胞中EMT标志物的mRNA和蛋白的表达水平。结果DCFH-DA染色观察发现，ARPE-19细胞加入BEV继续培养后，ROS和H2O2表达均明显上调（均为P＜0.05）。与空白对照组相比，BEV组EMT指标变化显著：上皮标志物ZO-1的表达降低，间质标志物α-SMA和FN的表达升高，两组间各指标相比差异均有统计学意义（均为P＜0.05）；与BEV组相比，BEV+NAC组和BEV+DPI组中各项指标mRNA表达变化显著，ZO-1上升至0.±0.、1.±0.，而α-SMA下降至0.±0.、1.±0.，此外FN表达（0.±0.、0.±0.）也显著降低，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。各种因子的蛋白表达变化趋势与其相应mRNA表达相一致，与单纯BEV组相比，ROS抑制剂NAC和NADPH氧化酶抑制剂DPI都显著改变了EMT标志物的表达，ZO-1蛋白相对表达量升高了0.±0.、0.±0.，而α-SMA下降了0.±0.、0.±0.，FN下降了0.±0.、0.±0.，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论ROS参与了BEV诱导的RPE细胞EMT，抑制ROS可减轻BEV诱导的人RPE细胞的EMT程度。
关键词
视网膜色素上皮细胞；上皮-间质转化；贝伐单抗；活性氧抑制剂
中图分类号
R
年龄相关性*斑变性(AMD)是指50岁以上人群*斑部出现玻璃膜疣、地图状萎缩（干性或萎缩型）和（或）脉络膜新生血管(CNV)及其引起的出血、水肿等（湿性或渗出型）严重损害视功能的不可逆致盲眼病，发病机制尚不完全清楚，但视网膜色素上皮（RPE）细胞在视觉活动中所产生的活性氧（ROS）在本病发生发展中的作用已得到肯定[1]。目前，干性AMD无有效治疗方法，含有抗氧化成分的食品被推荐给患者食用，以减缓病情进展[2]；湿性AMD的一线治疗方法是玻璃体内注射抗血管内皮生长因子（VEGF），以促使CNV萎缩、出血及渗漏停止，从而使视力提高或阻止视力下降；但抗VEGF治疗并不能中和促纤维因子，血管生成和组织纤维化因子之间的不平衡导致强烈的成纤维反应，新生血管过度纤维化严重影响了抗VEGF治疗的远期疗效[3]。因此，在抗VEGF治疗同时如何减轻CNV纤维化引起了广泛